Reagente de Bradford Pronto Para Uso
• Reagente de Bradford (pronto-para-uso)
• Para determinação da concentração de proteínas
• Código: 13-1309-05
• Volume: 500 mL
• (acompanha 4 mg de BSA)
• Armazenamento: 2-8°C
Descrição do produto:
• O Reagente de Bradford deve ser usado para determinar a concentração de proteínas em solução. O procedimento é baseado na formação de um complexo entre o corante, Brilliant Blue G, e proteínas em solução. O complexo formado entre a proteína e o corante provoca uma mudança na absorção máxima nas leituras entre 465 e 595nm. O valor de absorção é proporcional à concentração de proteína presente. O Reagente de Bradford não requer diluição e é ideal para microensaios, multiensaios e ensaios padrões. A linearidade do ensaio é de 0,1-1,4 mg/mL de proteína, usando BSA (albumina bovina sérica) como proteína padrão.
• O Reagente de Bradford é compatível com agentes redutores, que são comuns para estabilização de proteínas em solução. Outros ensaios para quantificação de proteínas (Lowry e BCA) não são compatíveis com tais agentes. O Reagente de Bradford deve ser utilizado no lugar destes ensaios se agentes redutores estiverem presentes. Entretanto, o Reagente de Bradford só é compatível com concentrações baixas de detergentes (vide tabela de compatibilidade). Se a amostra de proteína a ser utilizada possui detergente presente no tampão, sugere-se a determinação através do ensaio de BCA.
Reagente:
• O produto consiste em Brilliant Blue G com ácido fosfórico e metanol. Frasco com 500 mL mL é suficiente para, pelo menos 5.000 determinações. Acompanha 4 mg de padrão de proteína liofilizada (BSA) para ser diluída para a concentração de 1mg/mL em água deionizada.
Reagentes e equipamentos requeridos (dependendo do formato do ensaio)
– Espectrofotômetro capaz de realizar leitura de absorbância na faixa de 465 e 595 nm.
– Tubos de ensaio, 13 x 100 mm
– Cuvetas de 2,0 mL (espectrofotômetro de cuvetas)
Armazenamento e estabilidade:
• O produto se armazenado entre 2 e 8ºC é estável por 1 ano. A BSA reconstituída é estável por 60 dias entre 2 a 8ºC ou 6 meses entre -20 a -70ºC.
Procedimento:
1. Reconstituição do padrão de BSA
Para reconstituir o padrão de Albumina bovina sérica, adicionar 4 mL de água deionizada e agitar até dissolução completa. Se o padrão não for utilizado em 60 dias aconselha-se congelar em -20°C.
2. Protocolo sugerido:
2.1 Preparar entre 3 a 5 diluições da proteina padrão (BSA). A linearidade para o ensaio com BSA é de 0,1 a 0,9 mg/mL.
2.2 Pipetar 100 mL de cada padrão e amostra nos tubos recomendados. Ensaios com proteína normalmente são testados em duplicata ou triplicata.
2.3 Adicionar 5,0 mL da solução de Bradford pronta-para-uso e leve os tubos para agitação no vôrtex.
2.4 Incubar em temperatura ambiente pelo menos 5 minutos. A absorbância em 595 nm poderá se ver aumentada com o decorrer do tempo, levando a resultados não desejados. Assim os ensaios deverão ser finalizados no máximo em uma hora.
2.5 Realizar as leituras no espectrofotômetro (595 nm) como de costume, zerando o aparelho com água deionizada.
Referências:
1. Bradford, M.M., Anal. Biochem., 72, 248 (1976).
2. Compton, S.J. et al., Anal. Biochem., 151, 369-374 (1985).
3. Friedenauer, D. et al., Anal. Biochem., 178, 263-268 (1989).
4. Rubein, R.W. et al., Anal. Biochem., 83, 773-777 (1977).
5. Sedmak, J.J., and Grossberg, S.E., Anal. Biochem., 79, 544 (1977).
6. Sokuttgerber, A.G. et al., Anal. Biochem., 179, 198-201 (1989).
7. Tal, M. et al., J. Biol. Chem., 260, 9976-9980 (1985).
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