Easy Taq DNA Polymerase
Easy Taq DNA Polimerase
Catálogo nº: 13-10500
Apresentação: 500 unidades
Concentração: 5,0 U/mL
Armazenamento: – 20ºC
Não armazene em geladeira com sistema frost-free.
DESCRIÇÃO:
A enzima termoestável Taq DNA polimerase de Thermus Aquaticus é a forma recombinante da enzima expressa em Escherichia coli. Apresenta elevada processividade 5’à 3’, e uma atividade de exonuclease 5´- 3´, porém sem atividade exonuclease 3’à 5’.
A Taq DNA polimerase mostra excelente atividade em pH 8,5 á 72°C, sendo estável na incubação em elevadas temperaturas (95°C).
A enzima é constituída por uma cadeia polipeptídica simples com peso molecular de aproximadamente 94 kDa.
UNIDADE ENZIMÁTICA:
Uma unidade da Taq DNA Polimerase é definida como a quantidade necessária para incorporar 10 nmoles de dNTPs em 30 minutos a 72°C, em condições de ensaio padrão.
COMPONENTES:
– Enzima Taq DNA Polimerase,
– Tampão de amplificação 10X (livre de íons Mg2+),
– 50 mM de MgCl2
TAMPÃO DE ARMAZENAMENTO:
– 20 mM HEPES pH 7,9
– 100 mM KCl
– 0,1 mM EDTA
– 0,5 mM PMSF
– 1,0 mM DTT
– 50% glicerol
TAMPÃO DE REAÇÃO (10X):
– 100 mM TrisHCl pH 8,5
– 500 mM KCl
ENSAIOS DE CONTROLE DE QUALIDADE:
Atividade:
SDS-PAGE (pureza),
Espectrometria de massa (Figura 1),
OVER-DIGESTÃO: A incubação de 5U da Taq DNA Polimerase com 1 mg de DNA, em tampão de reação próprio durante 16 horas à 72°C, fornece um padrão de fragmentos de clivagem nítido, livre de DNA de E.coli [3].
PROTOCOLO BÁSICO DE AMPLIFICAÇÃO:
a) Utilizar microtubos estéreis de 0,2 – 0,5 mL.
Os tubos devem permanecer dentro de gelo.
Detalhes sobre parâmetros críticos e informações adicionais podem ser encontrados na referência [1].
Para obter um excelente rendimento na amplificação de fragmentos de DNA são aconselháveis, a utilização de um kit de pipetas exclusivas, ponteiras com barreira e ambiente livre de contaminação.
O protocolo sugerido serve como um guia geral e ponto inicial de protocolos de amplificação de DNA.
b) Homogeneizar a mistura, através de rápida centrifugação (fast-spin),
c) Incubar em termo bloco à 94°C por 3-5 min, para desnaturar o DNA,
d) Proceder com 20 – 35 ciclos de amplificação: desnaturação à 94°C por 45 s; anelamento à 55°C [**] por 30 s e extensão à 72°C por 1 min. Adicionalmente uma etapa de extensão à 72°C por 10 min é recomendada.
Manter à 4°C até a análise.
e) Analisar os produtos obtidos através de eletroforese em géis de agarose ou poliacrilamida, corando com brometo de etídeo e visualizando em luz ultravioleta.
Bibliografia:
[1] Innis, M. A. et al. (1990) PCR protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, San Diego, Ca.
[2] Chasseing, H. and Lipinski, R. (1998) Characterization of horse kidney metallotionein isoforms by electrospray MS. and reversed-phased HPLC-electrospray MS. Analyst 123: 2125.
[3] Bornema, J. and Triplet, F. W. (1997) Molecular microbial diversity in soil from Eastern Amazonia: evidence for unusual microrganisms and microbial population shifts associated with deforestation. Applied and Environmental Microbiology, 63: 2647.
OBS: ESTE PRODUTO É UTILIZADO ESTRITAMENTE EM PESQUISA CIENTÍFICA, NÃO RECOMENDADO PARA O USO EM DIAGNÓSTICO CLÍNICO OU TERAPÊUTICO
