O que é a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase – PCR?

Considerada uma técnica de biologia molecular, a Reação em Cadeia da Polimerase – em inglês, Polymerase Chain Reaction (PCR) – permitiu o rápido desenvolvimento do estudo de sequências de ácidos nucléicos.

© Depositphotos.com / lculig A Reação em Cadeia da Polimerase é uma técnica de biologia molecular que promove a duplicação de cadeias de DNA.

Desenvolvida por Kary Banks Mullis, em 1983, essa técnica consiste na síntese enzimática de cópias de ácidos nucléicos em laboratório, e não se utiliza de organismos vivos. Mullis recebeu o prêmio Nobel de Química de 1993 por sua descoberta.

A técnica de biologia molecular por PCR promove, in vitro e por meio de artifícios de variação de temperatura, o que o organismo realiza naturalmente em condições fisiológicas: a duplicação de cadeias de DNA, envolvendo nucleotídeos, sequências iniciadoras e enzima polimerases. Por meio deste processo, é possível a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucléico a partir de uma fita molde.

Cada ciclo é repetido em torno de 60 vezes, e promove a amplificação da região alvo determinada conforme afinidade das sequencias iniciadoras. Assim, o iniciador reconhece por complementaridade o local de início do local a ser amplificado, efetua a ligação e sinaliza para a polimerase o início da sequência a ser replicada.

Passo a passo

Para a realização deste procedimento, o primeiro passo é extrair o material genético da célula ou do local a ser estudado com cuidado para que o mesmo não seja danificado e nem sofra contaminação. Habitualmente, o material coletado é o DNA; todavia, pode-se utilizar também o RNA.

Após a extração do material, é adicionada uma mistura chamada de dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfato), sendo estas bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os denominados primers (também conhecidos por oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Este material vai para um aparelho conhecido como termociclador, aquecendo e esfriando o material ali contido em ciclos de temperatura pré-estabelecidos.

Primeiramente, o tudo é aquecido a uma temperatura entre 90° a 96°C para que ocorra a desnaturação do DNA (separação das fitas). Em seguida, a temperatura do termociclador cai (até 50° a 60°C) para que haja a hibridização ou anelamento. Neste ponto do procedimento, os primers se ligam com às suas sequências complementares do DNA. Há, então, uma elevação da temperatura a aproximadamente 72°C para que ocorra a síntese pela polimerase (extensão de uma nova molécula). Em seguida, um novo ciclo é iniciado, sendo que normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação, apresentado taxa de replicação exponencial.